Ni NTA Beads 6FF

產品貨號：N30210

儲存條件：2-8℃

產品簡介

LABLEAD的Ni親和層析介質屬于一類金屬螯合介質，以高流速瓊脂糖為基質，以次氮基三乙酸(NTA)或亞氨基二乙酸(IDA)為配基，并鰲合金屬離子Ni²⁺而形成的一種親和層析介質。該親和介質不僅具有吸附容量大、選擇性好、分辨率高、超低限度的Ni產泄露、易于再生、成本低等優點，還有利于保持產品的生物活性和提高產品的收率，從而廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質、核酸及多肽的分離純化，尤其是zu氨酸標記蛋白質的高效制備。

Ni NTA Beads 6FF產品特點：

可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件，適用性更廣，配體更穩定，選擇性更高；

可耐受最高0.3MPa的壓力，更穩定，可在相對較高的流速下，實現對目的蛋白的純化。

產品性能

操作說明

Ni NTA Beads 6FF可以在實驗室被填裝到HiQumnR中壓層析柱中，以擴大產量。將填料填裝到層析柱中，根據樣本量和填料載量選擇合適的層析柱和柱高。

1.1緩沖液準備

所用緩沖液需采用高純水配制，使用前建議用0.45um濾膜過濾。

平衡緩沖液：20 mM Tris-HCI 500mM NaCl， pH=7.4

洗滌緩沖液：20 mM Tris-HCI 500mM NaCl，10 mM咪唑，pH=7.4

洗脫緩沖液：20 mM Tris-HCl 500mM NaCl，500 mM咪唑，pH=7.4

1.2樣品準備

為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或微濾處理。進料量根據介質的載量和料液中目標蛋白的含量計算。

1.3 樣品純化

1)平衡：用5~10CV的平衡緩沖液平衡層析柱，至流出液電導和pH不變(與平衡液一致)。對于結合力較強的帶zu氨酸標記的蛋白質，平衡緩沖液中可加入低濃度(20~40 mM)的咪唑。

2)進樣：樣品緩沖液應盡可能與平衡液一致。固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析，高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。

3)淋洗：上樣完畢后繼續用平衡緩沖液淋洗至基線。

4)洗脫：

洗脫一般有兩種方式，

一是采用競爭試劑，例如咪唑(0~0.5M)、zu氨酸(0~0.05M)、氯化銨(0~2M)等將蛋白質從柱子上置換下來；

二是減小pH值，洗脫目標蛋白，大多數蛋白質在pH4~6的范圍內可被洗下來。用競爭試劑咪唑或減小pH值的方法洗脫蛋白質，金屬離子仍結合在柱子上；若用競爭試劑zu氨酸或氯化銨洗脫蛋白質，會將金屬離子和蛋白質的復合物一起洗下來。

注：

①為了減少雜蛋白在層析柱上的吸附，可在確保目標蛋白吸附的情況下適當增加樣品緩沖液中的咪唑。對于包涵體蛋白，相應的可在平衡、上樣和洗脫的緩沖液中加入8MUrea或6MGua-HCl

②洗脫緩沖液中必須加入0.15~1.0M NaCl，以消除離子交換作用。梯度洗脫最好在起始平衡液的恒定pH下進行，可采用線性梯度或階越式梯度洗脫。

5)再生：介質使用數次(具體與樣品特性、樣品體積、金屬離子等有關)后，或者螯合其他金屬離子前，需要進行再生處理。

首先用2~3CV的0.1M EDTA+0.5M NaCl pH7.0清洗柱子，并用2~3CV以上的0.5MNaCl溶液清洗，除去主柱上殘留的EDTA，然后再螫合相應的金屬離子。

若有變性蛋白質或脂類物質在再生過程中未能有效去除，可用原位清洗(CIP)的方法除去。

2原位清洗

為了避免不同樣品間的相互干擾，或者當介質污染比較嚴重時(反壓增加)，需要對介質進行在位清洗。在位清洗前，需要預先除去介質上螯合的金屬離子(見再生操作)。在位清洗時，可采用反向沖洗的方法。

1)對于以離子鍵結合的蛋白，可用2~3CV以上的2MNaCl清洗，并用3CV以上的純水沖洗。

2)對沉淀蛋白、以疏水性結合的蛋白或脂蛋白，可用1MNaOH清洗(1~2h)，并用3~10 CV平衡液和3CV以上的純水沖洗。

3)對疏水性結合的蛋白、脂蛋白和脂類物質，可用5~10CV的70%乙醇或30%異丙醇清洗(20min以上)，并用3~10CV的純水沖洗。

此外，也可用2CV含去污劑的堿性或酸性溶液清洗。如用0.1~0.5%的非離子去污劑+0.1M乙酸沖洗1~2h，并用5~10CV的70%乙醇沖洗去除去污劑，然后用3~10CV的純水沖洗。

重要提示：如果使用Xtrap預裝柱，可省略裝柱步驟。