貨號：P0243

存儲條件：-80℃，1年有效

干冰運輸。開封后，將無細胞蛋白表達反應(yīng)組分置于-80℃儲存。為避免反復(fù)凍融，可根據(jù)反應(yīng)用量，將A液和B液分別分裝后用液氮速凍后再置于-80℃儲存。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品說明

無細胞蛋白合成試劑盒（Cell-Free Protein Synthesis Kit）是一款基于大腸桿菌細胞裂解液進行體外蛋白質(zhì)合成的產(chǎn)品。該產(chǎn)品利用細胞裂解液中的核糖體、翻譯因子、酶等活性物質(zhì)，同時補加能量、核苷酸、氨基酸、無機鹽等，在體外重構(gòu)轉(zhuǎn)錄-翻譯體系。以DNA或RNA為模板，表達出蛋白質(zhì)。無細胞蛋白表達是一種不依賴于活菌，能夠快速、靈活地大量表達蛋白質(zhì)，和傳統(tǒng)的重組表達體系相比有眾多的優(yōu)勢：

1. 蛋白表達快，1~2 h即可表達出目的蛋白，8~24 h即可達到最大量。

2. 蛋白表達量高，最gao可達到3 mg/ml以上的蛋白。

3. 反應(yīng)簡單靈活，僅需向反應(yīng)體系中加入DNA或RNA模板，可使用96孔板或離心管進行反應(yīng)。

注：本貨號產(chǎn)品可表達常規(guī)蛋白，更適用于表達含二硫鍵的蛋白。

適用范圍

產(chǎn)品jin限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

操作說明

1. 基因構(gòu)建

目的基因的構(gòu)建對于蛋白表達至關(guān)重要，推薦使用下圖的構(gòu)建方式。可以將目的基因構(gòu)建到本試劑盒附帶的陽性質(zhì)粒上（質(zhì)粒圖譜詳見外包裝標簽掃描二維碼內(nèi)文件），即如下的構(gòu)建方式；也兼容pET9a、pET-23a 等含有T7啟動子，但不含乳糖操縱子（lac）的PET系列質(zhì)粒。

注：含有l(wèi)ac乳糖操縱子的質(zhì)粒（如pET28a等）會對產(chǎn)量有較大影響，不建議直接使用。

陽性質(zhì)粒的DNA序列示意圖如下所示：

2. 模板制備

無細胞蛋白合成試劑盒可以使用DNA或mRNA作為模板表達重組蛋白。采用的DNA模板可以是質(zhì)粒，可以是PCR產(chǎn)物，也可以是使用 phi29 進行RCA滾環(huán)擴增的產(chǎn)物。

2.1 質(zhì)粒：通過基因公司合成，或亞克隆獲得適用于無細胞反應(yīng)的質(zhì)粒，并采用柱純化方式提取質(zhì)粒；

2.2 PCR產(chǎn)物：設(shè)計引物，正向引物在T7啟動子上游200 bp左右，反向引物在終止密碼子下游200 bp左右（包含T7 terminator），對模板進 行擴增，獲得的DNA線性片段可以不經(jīng)純化直接投入到無細胞反應(yīng)體系中。上下游200 bp堿基的作用是保護DNA線性片段不被內(nèi)源性外切酶降解。

2.3 RCA產(chǎn)物：使用phi29聚合酶、隨機六引物進行滾環(huán)擴增RCA，獲得的DNA產(chǎn)物可直接用于無細胞反應(yīng)體系中。

2.4 PCR和RCA可以和Golden Gate以及Gibson Assembly聯(lián)用，將極大提高DNA模板制備的速度和通量。

2.5 DNA模板使用前需要準確定量；建議使用高質(zhì)量的質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取，避免引入RNase A；基因合成公司返回的質(zhì)粒需強調(diào)使用柱純化方式，否則不能直接用于無細胞反應(yīng)。

3. 無細胞蛋白表達

3.1 根據(jù)反應(yīng)體系總量計算所需的A液和B液（體積比1:2），將所用的試劑于冰上添加到反應(yīng)容器中（例如2 ml圓底離心管），并混勻。操作過程需全程佩戴手套、口罩，并采用無酶源的移液器吸頭和反應(yīng)容器，避免引入核酸酶。

無細胞反應(yīng)體系可參照下表進行混合配制：

3.2 向反應(yīng)體系中加入模板 DNA，推薦 DNA 模板的添加終濃度為 5~10 μg/ml，可對DNA 模板添加量進行優(yōu)化。

3.3 將反應(yīng)容器放置到普通搖床或恒溫混勻儀中，進行無細胞蛋白表達，推薦反應(yīng)溫度為25~30℃。降低溫度會降低蛋白的合成速率，但會增加蛋白的可溶性。一般反應(yīng)8 h左右即可達到最da的蛋白產(chǎn)量，也可以過夜反應(yīng)16 h。當(dāng)反應(yīng)溫度降低時，應(yīng)適當(dāng)增加反應(yīng)時間。

3.4 無細胞蛋白表達需要充足氧氣，當(dāng)使用2 ml圓底離心管作為反應(yīng)容器時，反應(yīng)體系不超過100 μl。無細胞蛋白反應(yīng)可以等比例放大，放大的反應(yīng)體系需要使用更大的反應(yīng)容器，例如搖瓶等，同時保證搖床的轉(zhuǎn)速（200 rpm）。

4. 檢測

反應(yīng)結(jié)束，取反應(yīng)液（檢測全部蛋白）或反應(yīng)上清（檢測可溶蛋白）1 μl左右，進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測目的蛋白的表達。

5. 陽性對照

本試劑盒中有綠色熒光蛋白sf-GFP質(zhì)粒作為陽性對照，可通過肉眼直接觀測反應(yīng)結(jié)果。sf-GFP成功表達后，無細胞反應(yīng)體系將呈現(xiàn)明顯的綠色。

如需對sf-GFP進行精確定量，可使用酶標儀進行檢測（Ex/Em=485/528 nm）。