YF®488TUNEL 細胞凋亡試劑盒

產(chǎn)品貨號：B0013

存儲條件：本產(chǎn)品應(yīng)置于-20℃儲存，組分 B 需避光，避免反復(fù)凍融。

注：組分 A 和 B 使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品介紹

細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解， 這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段為180 bp-200 bp的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜。本試劑盒采用 TUNEL 法，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞中斷裂DNA的3′-OH末端催化摻入 YF®/Cy-dUTP，YF®/Cy-dUTP 標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。TUNEL 法可以選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。標記的dUTP（如di高辛-dUTP、生wu素-dUTP），可以直接進行原位檢測，是一種更快速、直接的檢測手段。

使用方法

實驗材料（自備）

PBS 緩沖液（pH~7.4）

4%多聚jia醛（PBS 配制）

牛血清白蛋白（BSA）或正常的羊、牛血清

70%乙醇（自選）

脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）

實驗步驟

1.樣本準備：

（1）細胞樣品

a.可選：準備一份陰性對照樣本（加入不含TdT酶的TUNEL 反應(yīng)液）。

b.PBS 清洗細胞兩次。

c.細胞固定：加適量 4%多聚jia醛（pH 7.4），4℃放置 30 min

d.PBS 清洗細胞兩次。

e.通透細胞：細胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置 20 min。

f.PBS 清洗細胞兩次。

（2）石蠟組織切片

a.室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次 5 min，以徹di脫掉石蠟。

注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風(fēng)櫥中進行此操作。

b.室溫下，將樣本浸沒于無水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。

c.室溫下，將切片樣本連續(xù)依次浸沒在不同濃度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗 1 次， 每次5 min。

d.室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗 3 min，再將切片浸沒于1×PBS 中漂洗3 min，用濾紙小心吸干切片樣本周圍液體。

e.用免疫組化筆描繪樣本輪廓，以便下游通透與標記。

f.按 1: 100 的比例，將 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS 稀釋至終濃度 20 µg/mL，在每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育 20 min。（蛋白酶 K 的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化）。

注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，時間短達不到通透效果， 但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落。一般情況下，厚度 4 µm孵育 10 min，厚度 30 µm 孵育 30 min。

g.PBS 浸潤清洗切片 2 次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。

注：這一步必須把蛋白酶 K 洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應(yīng)。

（3）冰凍組織切片

a.將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫 20 min，晾干。

b.將載玻片浸沒在 4%多聚jia醛溶液中，室溫固定 30 min。

c.PBS 浸潤清洗切片 2 次，每次 5 min。

d.用濾紙小心吸干切片樣本周圍液體。

e.按 1: 100 的比例，將 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS 稀釋至終濃度 20 µg/mL，在每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育 20 min。（蛋白酶 K 的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化）。

注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，時間短達不到通透效果， 但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落。一般情況下，厚度 4 µm孵育 10 min，厚度 30 µm 孵育 30 min。

f.PBS 浸潤清洗切片 2 次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。

（4）陽性處理（僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行 TUNEL 反應(yīng)步驟）

a.按 1: 10 的比例用ddH2O 將 10× DNase I Buffer 稀釋成 1×DNase I Buffer 備用。

b.滴加 100 µL 1× DNase I Buffer 到已通透的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡 5 min。

c.用 1× DNase I Buffer 以 1: 100 稀釋 DNase I (2 U/μL)至終濃度 20 U/mL 的工作液。

d.輕輕吸掉多余液體， 加入 100 μL 濃度為 20 U/mL 的DNase I 工作液，室溫孵育 10 min。

e.輕輕吸掉多余液體，PBS 清洗樣品 2 次。

2.TUNEL 反應(yīng)

（1）每個樣本加入 100 μL TUNEL Equilibration Buffer，室溫孵育 5 min。

（2） 預(yù)先配制 TUNEL 反應(yīng)混合液： 每 50 μL TUNEL Reaction Buffer 中加入 1 μL TdT 酶。

（3）棄去 TUNEL Equilibration Buffer，每個樣本加入 50 μLTUNEL 反應(yīng)混合液。

a.貼壁細胞，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育 60 min。

b.懸浮細胞，可加入微孔板中，采用微孔板振蕩器進行孵育或每隔 15 min 溫和的震蕩反應(yīng)管，使之充分反應(yīng)。37℃ 避光孵育 60 min。

c.組織樣本，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。將樣本平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育 2 h（濕盒底部鋪一張含少量水的紙巾保持濕度）。

（4）去掉反應(yīng)液，在 1× PBS 的染色缸中浸泡潤洗 2 次，每次 5 min。再使用適量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100， 其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本 3 次，每次 5 min， 以降低背景。

（5）（可選）復(fù)染：每個樣本滴加濃度為 2 μg/mL 的 DAPI染液，室溫避光孵育 10 min。染色完成后，去掉染液，并將樣本在 1× PBS 中浸泡潤洗 3 次，每次 5 min。

（6）（可選）石蠟切片封片：將切片依次在純水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中浸沒 5 min， 最后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡，透明化處理 2 次，每次 5 min。脫水完成后，擦去切片周圍的液體， 每個樣本滴加 50 μL 抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片wan全。

7) 用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察。（凋亡細胞應(yīng)被標記上明亮的熒光，沒有加入 TdT 酶的陰性對照樣本不能被標記上熒光）。

注意事項

1.熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。