異硫氰酸熒光素

產品貨號：0633-1

儲存條件：4℃干燥避光保存，2年有效。

產品描述

FITC，英文全稱Fluorescein Isothiocyanate，中文名稱異硫氰酸熒光素，具有高吸收率、優良的熒光量子產率和良好的水溶性等特點，是生物學中應用最wei廣泛的一種綠色熒光素衍生物，其異硫氰酸基團可與蛋白的氨基末端或者伯胺反應從而實現包括抗體，凝集素在內的蛋白標記。

產品性質

應用

除了用作蛋白質標記物，還可用作蛋白質熒光示蹤劑，標記抗體用以快速鑒定病原體，以及用于蛋白質和多肽（HPLC）的微量測序。FITC為黃-橙色粉末，最da激發波長為494 nm。一旦激發，在最da發射波長520 nm處呈黃-綠色熒光。

FITC有兩種異構體，異構體I（Isomer I）和異構體II（Isomer II）,二者在光譜性質上基本沒有差異（無論是波長還是光強度），但是前者更易純化，所以相對便宜，應用也較為廣泛。對于大部分應用，混合型的FITC已能很好的滿足實驗要求。本品Isomer I含量≥90%，適合用于蛋白質標記。

使用方法

1. 標記蛋白

1）制備溶于0.1 M碳酸鈉緩沖液（pH 9）的待交聯蛋白樣品，濃度≥2 mg/mL。

【注】

a）勿將碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液存放于0-5℃超過1周，其pH值會發生變化，建議現配現用。

b）待標記的蛋白必須是未被污染蛋白，且溶解蛋白的緩沖液里不能含有疊氮鈉或胺類試劑，如Tris、甘氨酸，因為這些試劑會抑制標記反應。如果緩沖液里含有上述試劑，則需將該蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析過夜；透析過程中如果pH值過高（＞8.0-8.5）會損害某些蛋白。

2）溶解FITC于無水DMSO配制成濃度為1 mg/mL的溶液。

【注】于標記實驗前新鮮配置FITC溶液，避光。

3）對于1 mL 蛋白溶液加入50 µLFITC溶液，可按照每次5 µL的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液；

4）待所需FITC加入完畢，將反應液于4℃避光孵育8 h；

5）加入NH4Cl使其終濃度至50 mM，4℃終止反應2 h；

6）加入二甲苯青至濃度0.1%，甘油至濃度5%；         

7）通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結合的FITC，分離范圍在20，000至50，000（球蛋白例如抗體）。待凝膠柱平衡后，將以上反應混合液從柱頂注入，打開凝膠柱，待其全部流入柱床后，加入PBS緩沖液。

此時，可以形成兩條帶：a，快速移動帶，也就是FITC-蛋白偶聯物，先被洗脫，通常于室內光下可看到；b，慢速移動帶，也就是未結合蛋白的FITC和二甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來。

8）于4℃避光儲存上述偶聯物，加入0.1%（w/v）疊dan化na作為一種防腐劑。若蛋白濃度較低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作為一種蛋白穩定劑。

9）偶聯物中熒光素和蛋白的比值（F/P）可通過測定495 nm和280 nm處的吸光值來鑒定，F/P應位于0.3-1.0。小于該比例則信號太低，高于該比例則背景太高。

2. 熒光素/蛋白摩爾比（F/P）的測定

F/P摩爾比即熒光素蛋白偶聯物中FITC與蛋白質的摩爾比。為了計算該值，首先需測定該偶聯物在280nm和495nm的吸光值：將已標記蛋白樣品置于石英比色皿中，測得A280和A495，2.1 對FITC-IgG標記物

F/P摩爾比計算公式為：Molar F/P=[2.77×A495] / [A280-（0.35×A495）]

FITC-IgG偶聯物濃度計算公式為：IgG（mg/ml）=[A280-（0.35×A495）] / 1.4

【注】該處1.4，指的是大多數物種IgG 以濃度為1mg/ml在pH7.0的條件下測得的A280為1.4。

2.2 對于其他FITC-蛋白質（非IgG）偶聯物

F/P摩爾比計算公式為

【注】

C對一種蛋白質而言是一常數；MW是蛋白質分子量；389是FITC的分子量；

195是FITC偶聯物在pH13, 490 nm處的吸光值E0.1%；

（0.35×A495）是基于FITC A280的校正因子；

E0.1%是某一蛋白（1.0 mg/mL）在280 nm處的吸光值。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產品僅作科研用途！