Flag-Magnetic 免疫沉淀試劑盒（PROCAP Flag-Magnetic IP/CoIP KIT）

貨號：PFM025

存儲條件：-20°C保存。Flag-Magnetic beads經常使用可在4℃保存，在-20或-80℃長期保存，避免反復凍融。

試劑盒組分：

產品簡介：

   LABLEAD的免疫沉淀beads是基于基因工程改造的納米抗體開發的；納米抗體由傳統抗體的重鏈可變區（VHH）組成，具有分子量小、親和力高、特異性強，且耐酸堿高溫環境等特點；基于納米抗體的優點，LABLEAD的免疫沉淀beads避免了免疫沉淀結果出現輕重鏈污染的現象，并且節省實驗時間。

實驗步驟：

提示：盡量在4℃進行操作，洗脫蛋白方法一除外。

1.植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul 裂解液A或裂解液B（需加入PMSF溶液）進行裂解，為了提高裂解效率，可加入 200ul 玻璃粉按照600-800g離心力充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心30min，吸取上清置于新的離心管中，棄去沉淀。（進行第3步）

2. 動物細胞裂解

2.1 收集細胞：

根據實驗要求收集適量的細胞，通常每個免疫沉淀反應大約使用 10⁶-10⁷ 個細胞。

2.2 裂解細胞：

根據實驗要求選擇使用溶液A或溶液B裂解細胞。在溶液A或溶液B中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預冷的溶液A或溶液B重懸細胞；置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次；4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。

3. 平衡珠子：

振蕩充分混勻珠子，吸取40μl Flag-Nanoab-Magnetic beads到500μl預冷的溶液A或溶液B中，4℃，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟棄上清液。（此步驟可選）

3. 結合蛋白：將平衡好的beads（如果未做第 4 步，可在細胞裂解產物中直接加入40μl slurry）加入到細胞裂解產物中，于4℃旋轉混合結合30min-1h。在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟棄上清液。

5. 清洗珠子：

根據實驗要求選擇使用溶液C或溶液D清洗beads。4℃，利用磁性分離，丟棄上清液。

用500μl預冷的溶液C或溶液D重懸beads，4℃，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態，丟棄上清液并重復洗滌 2 次。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）。

6. 洗脫蛋白

方法一：

加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸beads。95℃，加熱10min充分變性，Flag-Nanoab-Magnetic Beads 可在磁力架上進行分離，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：

加入溶液E洗脫結合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，利用磁性分離收集上清，為了中和酸性的甘an酸，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。

注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

注意事項：

1、關于裂解液與裂解液的選擇：

裂解液A為溫和裂解液，裂解液B為強裂解液，請根據自己實驗樣本選擇相應的裂解液，如：若為胞質蛋白可選裂解液A或者A與B混合使用，若為核蛋白則可選擇裂解液B。

漂洗液C和漂洗液D的選擇：（裂解液D為高鹽溶液，可能會破壞蛋白間較弱的相互作用），若兩個蛋白相互作用強，同時還想減少非特異性結合，可選D；若兩個蛋白相互作用弱的優先C。

2、盡量避免過多的反復凍融。可以適當分裝后使用。

3、本產品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。