Flag-Agarose 免疫沉淀試劑盒

貨號：PFA025

存儲條件：-20°C保存，F(xiàn)lag-Agarose beads經(jīng)常使用可在4℃保存，-80或-20℃長期保存，避免反復(fù)凍融。

試劑盒組分：

產(chǎn)品簡介：

   LABLEAD的免疫沉淀beads是基于基因工程改造的納米抗體開發(fā)的；納米抗體由傳統(tǒng)抗體的重鏈可變區(qū)（VHH）組成，具有分子量小、親和力高、特異性強(qiáng)，且耐酸堿高溫環(huán)境等特點(diǎn)；基于納米抗體的優(yōu)點(diǎn)，LABLEAD的免疫沉淀beads避免了免疫沉淀結(jié)果出現(xiàn)輕重鏈污染的現(xiàn)象，并且節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)步驟：

提示：盡量在4℃進(jìn)行操作，洗脫蛋白方法一除外。

1.植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。加入500-1000ul 裂解液A或裂解液B（需加入PMSF溶液）進(jìn)行裂解，為了提高裂解效率，可加入 200ul 玻璃粉按照600-800g離心力充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清置于新的離心管中，棄去沉淀。（進(jìn)行第3步）

2. 動(dòng)物細(xì)胞

2.1 收集細(xì)胞：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求收集適量的細(xì)胞，通常每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)大約使用 10⁶-10⁷ 個(gè)細(xì)胞。

2.2 裂解細(xì)胞：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇使用溶液A或溶液B裂解細(xì)胞。在溶液A或溶液B中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預(yù)冷的溶液A或溶液B重懸細(xì)胞；置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次；細(xì)胞裂解物4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的預(yù)冷管中，丟棄沉淀。

3. 平衡珠子：

振蕩充分混勻珠子， 吸取20μl Flag-Nanoab-Agarose beads到500μl預(yù)冷的溶液A或溶液B中，4℃，2,500g離心2分鐘，丟棄上清液。

4. 結(jié)合蛋白：

將平衡好的beads加入到細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合30min-1h。

5. 清洗珠子：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇使用溶液C或溶液D清洗beads。4℃，2,500g 離心2分鐘，丟棄上清液。用500μl預(yù)冷的溶液C或溶液D重懸beads，4℃，2,500g條件下離心2分鐘，丟棄上清液并重復(fù)洗滌3次。

6. 洗脫蛋白

方法一：

加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸beads。95℃，加熱10min充分變性，2,500g離心2分鐘收集上清，收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：

加入溶液E洗脫結(jié)合的蛋白，孵育時(shí)間30秒，期間不斷混勻，2,500g離心2分鐘收集上清，為了中和酸性的甘氨酸，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。

注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

注意事項(xiàng)：

1、關(guān)于裂解液與裂解液的選擇：

裂解液A為溫和裂解液，裂解液B為強(qiáng)裂解液，請根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)樣本選擇相應(yīng)的裂解液，如：若為胞質(zhì)蛋白可選裂解液A或者A與B混合使用，若為核蛋白則可選擇裂解液B。

漂洗液C和漂洗液D的選擇：（裂解液D為高鹽溶液，可能會(huì)破壞蛋白間較弱的相互作用），若兩個(gè)蛋白相互作用強(qiáng)，同時(shí)還想減少非特異性結(jié)合，可選D；若兩個(gè)蛋白相互作用弱的優(yōu)先C。

2、盡量避免過多的反復(fù)凍融。可以適當(dāng)分裝后使用。

3、本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

4、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。